Desigur, inainte de a citi acest
articol trebuie sa cititi articolele precedente referitoare la obtinerea
culturii lichide si cum se sterilizeaza cerealele.
Ei bine, este timpul sa inoculam
cerealele cu LC pentru a obtine Spawnul.
Pregatim o seringa noua si
trecem la fapte, intr-un mediu cat mai curat posibil sau in cazul in care v-ati
pregatit un glove box si mai bine.
In primul rand stergem cu grija
usita(locul)de inoculare al borcanului de LC cu un tampon de vata sau o
discheta demachianta, imbibata in apa oxigenata.
Acest lucru facut, luam un alt
tampon inmuiat si-l pozitionam deasupra usitei de inoculare, asa distrugem
eventualii contaminanti ramasi.
Acum trebuie sa actionam cat mai rapid si aseptic
posibil: scoatem seringa din ambalaj si rapid introducem acul (18G) in usita de
inoculare, inclinam borcanul cat este necesar astfel incat acul sa ajunga la
lichid.
Atentie sa nu udati filtrul, pentru motivele deja cunoscute!
Obiectivul nostru este sa reusim
sa aspiram cat mai mult miceliu posibil in seringa: in timpul cresterii miceliu
o masa unica, care nu trece usor prin ac.
Din acest motiv trebuie “rupta” in
filamente masa de miceliu aspirand si sufland de mai multe ori lichidul.
Toata
procedura trebuie, evident, facuta fara a scoate acul din borcan.
Dupa ce am reusit sa aspiram o
cantitate suficienta de miceliu, putem sa scoatem acul din borcan.
Ajunsi in acest punct este bine
sa sterilizati acul seringii cu flacara, inainte de a inocula punga, daca
lucrati in interiorul glove- boxului desfaceti capacul cu filtru si pulverizati
in interior un pic de lichid, cat mai rapid posibil.
Daca nu aveti glove-box trebuie
sa injectati lichidul intepand punga in cel putin doua puncte diferite tinand
pe ac un tampon de vata imbibat in alcool sanitar, apoi acoperiti gaura cu o
bucatica de banda izolanta.
Cu putina atentie e posibil sa
inoculati diferite pungi cu o singura seringa de LC, e suficient ca in fiecare
sa ajunga cateva filamente de miceliu.
Daca acest articol ti-a fost
util, lasa-ne un comentariu si distribuie, Multumesc
Am mentionat deja, necesitatea de a lucra intr-un mediu cat mai curat
posibil.
Pentru a fi posibil acest lucru,
trebuie sa confectionati un glove box in care sa lucrati.
Este de fapt o cutie, preferabil
de plastic, cu doua gauri decupate in care sa puteti introduce mainile, al
carui interior trebuie sa fie curat si dezinfectat cu alcool sau cu un alt tip
de dezinfectant inainte de a incepe procedura.
Dupa decuparea celor doua gauri,
adaugati doua bucati de tub de plastic, fixate cu doua maneci taiate de la o salopeta
Tyvek alba.
In ceea ce priveste dimensiunea, aveti grija sa nu
folositi o cutie prea mica.
Ulterior, dupa ce ati pus in
glove box toate materialele necesare ( de exemplu borcanele de LC, ciupercile
pentru clonare, bisturiul, seringa etc.) o inchideti pentru a impiedica sa
patrunda aerul.
Poate vi se pare ciudat, nu avem
nevoie de echipamente profesionale, ne putem descurca cheltuind putini bani.
De precizat, interiorul glove
boxului chiar si foarte bine curatat, nu va fi complet steril, oricum functioneaza,
pentru ca aerul ramane acolo, astfel impiedicand miscarea contaminantilor in
spatiul de lucru.
Lasand peretii glove boxului usor umezi cand dezinfectam ne ajuta, deoarece
sporele raman lipite, fara sa ne mai deranjeze.
Un sistem mult mai evoluat (si
comod!) care ne asigura o zona necontaminata este hota cu flux laminar, sau flow hood.
Este vorba despre o cutie
formata dintr-un ventilator care sufla
aer printr-un filtru HEPA, care retine
toti contaminantii.
Aerul care iasa din filtru este
complet steril: lucrand in fata fluxului de aer, putem fi siguri ca suntem
protejati impotriva contaminantilor din aer.
Principalul inconvenient
al flowhood-ului este fara indoiala, pretul: cu filtru, ventilator si structura,
se poate ajunge in jurul cifrei de 300 €.
Daca acest articol ti-a fost
util, lasa-ne un comentariu si distribuie, Multumesc
Inainte de a citi acest articol,
va recomand sa cititi partile 1,2 si 3Cultura Lichida ( L.C.)
Odata ce LC noastra este
pregatita (poate veti avea nevoie de mai multe incercari), vine si momentul sa
o folosim.
Cu toate acestea, nu este o buna
idee s-o injectati direct pe substratul final (paie, rumegus, butuci de lemn
etc.), pentru ca dezvoltarea ar fi extrem de lenta, sau nici nu ar incepe.
Prin urmare un pas intermediar este
necesar, pentru a-i da miceliului nostru “o viteza-n plus”, permitandu-i sa
creasca in mod rapid si agresiv.
Acest pasaj intermediar este,
tocmai, pregatirea “spawn-ului”(in engleza, literalmente inseamna a genera, a
multiplica).
Spawn-ul este o metoda pentru
multiplicarea miceliului, obtinand suficient pentru a putea inocula substratul
final.
Metoda cea mai utilizata consta
in folosirea semintelor de cereale hidratate si sterilizate: avand un nivel
proteic ridicat, permit miceliului sa creasca rapid si puternic.
Totusi semintele nu sunt
potrivite pentru a permite fructificarea, in ipoteza cea mai buna din ele am
obtine doar cateva ciupercute, dar noi vrem o recolta bogata, nu-i asa?
Semintele trebuie neaparat utlizate in inocularea substratului final: in
acest fel actioneaza ca un supliment nutritiv, si asigura o colonizare rapida,
ceea ce LC singura, nu ar putea.
Cea mai buna cereala(cea mai utilizata) in
absolut pentru pregatirea Spawn-ului este secara, de asemenea graul, meiul,
sorgul si orzul.
Puteti folosi si hrana pentru perusi care adesea este compusa
in principal din mei.
In acest ghid vom folosi graul. Punem
graul intr-o oala si turnam apa fierbinte peste pana il acoperim.
Aceasta faza are functie dubla:
hidratarea semintelor, pana le aducem la gradul potrivit de umiditate interna
si sa germineze endosporele, care ar putea rezista sterilizarii.
Punem capacul pe oala si
asteptam 24-28 de ore.
Trecute aceste ore, indepartam
capacul si observam ca s-a format o usoara spuma la suprafata. Acest lucru se
datoreaza faptului ca sporele continute in boabele de grau sunt germinate si
bacteriile au inceput sa fermenteze.
Scurgem apa (cu o strecuratoare)
si le trecem printr-un jet de apa rece (asa inlaturam eventualele reziduri de
murdarie).
Dupa cum se poate observa, boabele de grau sunt vizibil mai mari
datorita apei absorbita.
Daca am fi folosit mei, acesta
avand bobul mult mai mic, ar fi trebuit sa-l fierbem cel putin 15 minute,
astfel incat acesta sa aiba posibilitatea sa absoarba cat mai multa apa, pentru
a evita uscarea excesiva in timpul colonizarii.
Aceasta operatiune in cazul
graului nu este necesara deoarece boabele sunt destul de mari sa absoarba apa
necesara.
Acum este momentul sa umplem
pungile autoclavabile, punem capacul insurubabil cu filtru in partea superioara, peste punem o
folie de aluminiu prinsa cu un elastic. Sterilizam totul intr-o oala sub
presiune timp de cel putin 2 ore.
Continutul de solide necesita
mai mult timp in comparatie cu cel de lichide.
In doua ore vom fi siguri ca
mijlocul fiecarei pungi a atins 120°C, o perioada suficienta pentru a ucide
toti contaminantii.
Lasam sa se raceasca oala pana la temperatura camerei (cateva ore)
Odata racite, pungile pot fi
inoculate.
Boabele de grau se micsoreaza in
timpul sterilizarii, dar oricum isi pastreaza un grad de umiditate suficient
incat sa se poata dezvolta rapid miceliul nostru.
In urmatorul articol, veti vedea
cum se inoculeaza pungile.
Daca acest articol ti-a fost
util, lasa-ne un comentariu si distribuie, Multumesc Magazin on-line
Pentru a intelege aceasta Parte,
trebuie sa fii citit Partile 1 si 2.
Exista multe modalitati de a
inocula un borcan de solutie nutritiva ca si acela pe care l-am pregatit: cea
mai simpla este sa injectati in interiorul acestuia putin
LC deja pregatit, dar acest fapt
implica sa aveti deja la dispozitie o seringa de miceliu lichid(LC), in
prealabil cumparata de la un laborator specializat.
In acest articol vom vorbi
despre una dintre tehnicile de clonare, care ne va permite sa obtinem singuri
cultura noastra, plecand de la o ciuperca deja formata.
Desi titlul pare cel a unui film
SF, e adevarat: vom pune in practica o
adevarata clonare, un procedeu mult mai simplu decat cel utilizat in cazul oitei
Dolly.
Nu este vorba tocmai despre o operatiune foarte simpla, de aceea trebuie sa ne luam toate masurile de precautie
posibile, pentru ca totul sa decurga bine.
Miceliul are capacitatea de a se reproduce din tesutul ciupercii,
chiar de el generat.
Prin taierea unui fragment de
ciuperca si pozitionarea acestuia intr-un mediu prielnic (prezenta
nutrientilor, absenta mucegaiurilor si bacteriilor) miceliul se va reproduce, dupa cateva zile vom observa fragmentul de
ciuperca acoperit cu un puf alb.
In situatia noastra, obiectivul
este prelevarea unui fragment de ciuperca si reusirea introducerii acestuia in
borcan.
Problema este ca, pentru a face
acest lucru, nu trebuie sa deschidem capacul. De fapt, in aerul normal respirat
de noi sunt prezente continuu milioane de spore ale bacteriilor si
mucegaiurilor, prin urmare, si riscul ca vreuna sa patrunda in borcan este foarte
mare in momentul deschiderii capacului.
Multe tipuri de mucegai cresc
foarte rapid si nu i-ar da miceliului nostru cel putin sansa de a se dezvolta.
Trebuie sa recoltam fragmentul
de ciuperca cu o seringa si sa-l injectam in interiorul borcanului, prin orificiul(usita)
de inoculare(cea de silicon) pregatita anterior urmarind instructiunile
furnizate.
Procedura se desfoara cu maxima precautie, intr-un
mediu cat mai curat posibil, recoltand
fragmentul de ciuperca dintr-un punct
foarte curat, utilizand o seringa sterilizata.
Gata cu vorbele, sa trecem la
fapte, mai exact sa vedem cum se face: seringile noi sunt sterile, folosim un
ac de 18G (cele mici, nu ar functiona), manusi din latex (daca nu folositi
manusi trebuie sa va spalati foarte bine pe maini si sa va dezinfectati), scoatem
seringa din amabalaj, indepartam elasticul si folia de aluminiu de pe capac,
aspiram cativa ml de solutie. Atentie sa nu udati filtrul, daca se intampla
acest lucru, trebuie s-o luati de la capat .
Imediat punem un tampon de vata sau o discheta demachianta
imbibata in apa oxigenata sau alcool
sanitar pe usita de inoculare.
Apoi, sterilizam acul seringii
cu flacara, pana cand acesta devine complet rosu; atentie sa nu topiti
plasticul seringii.
Asteptam ca acul sa se raceasca (circa
10 secunde) si intepam ciuperca in zona
proaspat curatata si dezinfectata.
Daca clonam o ciuperca mai mare,
de exemplu Pleurotus, putem sa rupem palaria in doua jumatati, si sa recoltam
tesutul de pe interna, care in general este mult mai curata si nu trebuie
dezinfectata.
Ajunsi in acest punct, daca am
procedat corect (si cu un gram de noroc), cu siguranta un fragment de ciuperca a ramas in acul seringii.
Vom continua cu
injectarea in interiorul borcanului,
indepartand tamponul de vata aflat pe orificiul de silicon inainte de a
introduce acul.
Daca totul s- a desfasurat bine putem observa fragmentul de ciuperca plutind in
lichid.
In decurs de 5-7 zile ar trebui sa observam un strat
subtire de puf acoperind fragmentul de ciuperca. Cu totul altfel va arata lichidul
nostru, daca am gresit ceva, in cateva zile acesta devenind alb-gri murdar si
urat mirositor.
In poza puteti observa cum
trebuie sa se prezinte solutia in cazul reusitei. Cum se poate vedea, miceliul
creste direct din fragmentul de tesut. Daca doriti sa accelerati dezvoltarea
miceliului este suficient sa agitati borcanul din cand in cand, in scopul de a
rupe miceliul in multe filamente.
Fiecare dintre acestea se va
dezvolta, accelerand procesul.
De retinut: sa fim atenti mereu
sa nu umezim filtrul, intr-adevar mierea continuta in lichid ar putea favoriza
contaminarea solutiei, dar odata ce lichidul va deveni complet transparent
insemana ca LC nostru este gata pentru a fi folosit, deoarece miceliul a consumat toti nutrientii.
In acest punct sunteti pregatiti
pentru faza succesiva, inocularea spawnului (miceliu pe baza de cereale).
P.S. Daca acest articol ti-a fost
util, lasa-ne un comentariu si distribuie, Multumesc Magazin on-line
Pentru a intelege aceasta Parte,
trebuie sa fii citit Partea 1.
Masuram apa distilata si o
varsam in borcan(300ml), cu un cantar electronic sa dozam cantitatea de miere,
altfel punem o lingurita generoasa la 300 ml(apa). In cazul nostru, la 300 ml(apa)
e nevoie de 4%=12 g de miere(pentru siguranta mai bine punem 9-10g).
Amestecam bine pana mierea se
dizolva complet in apa, apoi inchidem borcanul si punem o folie de aluminiu pe
capac, fixand-o cu un elastic( de obicei rezista fara probleme la sterilizare).
Ajunsi in acest punct, solutia
trebuie sterilizata.
De fapt, zaharul din miere nu-i place doar (viitorului) nostru
miceliu ci, de asemenea, multitudinilor de bacterii si mucegaiuri, ale caror
spore sunt in mod sigur deja prezente in interiorul borcanului, si cu siguranta
ar castiga lupta”pentru supravietuire”. In orice caz, cele 120° grade ale oalei sub presiune sunt suficiente pentru
a scapa de ele.
Asezam borcanul in oala, varsam
un pic de apa in aceasta, poate sa para putina, dar este suficienta, deoarece
vaporii generati in interiorul oalei transmit caldura la borcane.
L.C. contaminata
Daca oala nu este dotata cu
distantiere, borcanele nu trebuie sa atinga fundul oalei, puneti sub acestea un
prosop, o carpa, pentru a evita miscarea acestora in timpul sterilizarii.
Odata rezolvate aceste mici
incoveniente, inchidem oala sub presiune si sterilizam nu mai mult de 15 minute
( altfel se pot forma reziduuri, care impiedica colonizarea), incepand sa
cronometram la auzul primului fluierat,
al oalei.
Trecute cele 15 minute, oprim
gazul, lasam oala sa se raceasca fara a deschide valva, prin urmare, am
terminat aceasta faza. Iata cum trebuie sa se prezinte un borcan gata pregatit
pentru inoculare: lichidul se prezinta usor opac din cauza mierii dizolvate in
apa.
Odata inoculat, daca totul decurge bine, veti observa ca va deveni tot mai transparent, pe masura ce miceliul va consuma
nutrientii.
Daca observati ca in borcanul
scos din oala lichidul deja se prezinta complet transparent, cu reziduuri albe
depozitate in partea de jos, inseamna ca ceva nu a mers bine. In acest caz
incercati o alta marca de miere sau sa sterilizati mai putin timp (10-12
minute).
Ei bine! pentru moment si
aceasta faza este finalizata.
Nu pierde faza urmatoare! Partea
3
P.S. Daca acest articol ti-a fost
util, lasa-ne un comentariu si distribuie, Multumesc Magazin on-line
Asa cum am promis, iata procedeul
de pregatire a miceliului in casa, cu tehnici de laborator, aceasta va fi prima
dintre multele pe care o sa vi le prezint, nu va fi simplu pentru ca nu
dispunem de instrumente profesionale, dar daca aveti rabdare si vointa veti
reusi sa va atingeti obiectivul, priviti-o ca pe o competitie cu voi insiva.
Tehnicile
pe care o sa vi le prezint acum sunt adresate doar incepatorilor, hobbystilor,
sau pentru cine cultiva pentru uz casnic, nu celor care vor sa inceapa o mica
afacere.
Cultura lichida care de acum
inainte o vom numi LC(Liquid
Culture) consta in Miceliu cultivat in
solutie de apa distilata si nutrienti, care pot fi de diferite tipuri(pentru inceput
vom folosi mierea). Ca si recipiente vom folosi
borcane de sticla, totusi este necesar sa se faca o modificare la capace: se
aplica un filtru pentru a permite schimbul de gaze, si se creeaza o “usa” de
inoculare care ne permite sa inoculam borcanele si sa aspiram miceliul la
momentul potrivit.
Luam borcanul, desfacem capacul
si (cu o masina de gaurit) facem doua gauri in cele doua parti ale capacului,
una mai mica si una mai mare ( aveti grija sa nu distrugeti filetul!).
Aplicam putin silicon atat pe
partea superioara cat si pe cea interioara, astfel incat sa ramana putin in
relief pe ambele parti: odata uscat siliconul(sunt necesare cateva ore circa),
aplicam filtrul pe gaura cea mai mare, se pot folosi butoni autoadezivi din pasla,
se gasesc la Dededeman, Praktiker etc., se aplica de exemplu la picioarele de
la scaun ca sa protejeze parchetul.
Dupa pregatirea capacelor, putem face pasul urmator: prepararea solutiei in
care sa cultivam miceliul.
E posibil sa folosim diferite tipuri de
nutrienti: miere, sirop de artar, extract de malt, zahar brun, etc.
Preferinta, in orice caz, este
data de substanta care, dupa ce a fost amestecata cu apa, va lasa solutia cat
mai transparenta posibil.
Intr-adevar, o eventuala
contaminare bacteriana s-ar manifesta cu o neasteptata opacizare a solutiei,
care ar deveni laptoasa si urat mirositoare.
In acest ghid va explic
pregatirea clasica cu miere de salcam, fie vorba intre noi nu este ingredientul
cel mai bun, dar functioneaza destul de bine. Nu ezitati sa experimentati si
alte ingrediente.
Procentul de nutrienti care
trebuie adaugat este scazut de la 2% la
4%. Nu funcioneaza regula mai multi nutrineti = o crestere mai rapida. Dimpotriva,
daca adaugati prea multa miere dezvoltarea poate fi foarte lenta, sau nici
macar nu incepe.
Nu pierde faza urmatoare!
Daca acest articol ti-a fost util, distribuie acest link, multumesc
